Faktè entèferans nan reyaksyon PCR

Pandan reyaksyon PCR la, yo souvan rankontre kèk faktè entèfere.
Akòz sansiblite trè wo nan PCR, kontaminasyon konsidere kòm youn nan faktè ki pi enpòtan ki afekte rezilta PCR epi li ka pwodwi fo rezilta pozitif.
Egalman kritik yo se divès sous ki mennen nan rezilta fo-negatif. Si youn oswa plis pati esansyèl nan melanj PCR la oswa reyaksyon anplifikasyon an li menm yo anpeche oswa entèfere, tès dyagnostik la ka anpeche. Sa a ka mennen nan efikasite redwi e menm fo rezilta negatif.
Anplis anpèchman, pèt entegrite asid nikleyik sib ka rive akòz anbake ak/oswa kondisyon depo anvan preparasyon echantiyon an. An patikilye, tanperati ki wo oswa depo apwopriye ka lakòz domaj nan selil ak asid nikleyik. Fiksasyon selil ak tisi yo ak entegrasyon parafin yo se kòz ki byen koni nan fwagmantasyon ADN ak yon pwoblèm ki pèsistan (gade Figi 1 ak 2). Nan ka sa yo, menm izolasyon optimal ak pirifikasyon pa pral ede.

Figi 1 | Efè imobilizasyon sou entegrite ADN
Elektwoforèz jèl agaroz te montre ke bon jan kalite ADN izole nan seksyon parafin otopsi yo te varye anpil. ADN nan diferan longè fragman mwayèn te prezan nan ekstrè yo depann sou metòd la fikse. ADN te konsève sèlman lè yo fikse nan echantiyon natif natal nan frizè ak nan fòmalin net tanpon. Itilizasyon yon fikse Bouin ki gen anpil asid oswa fòmalin ki gen asid fòmik san tampon te lakòz yon pèt enpòtan nan ADN. Fraksyon ki rete a trè fragmenté.
Sou bò gòch la, longè fragman yo eksprime an pè kilobaz (kbp)

Figi 2 | Pèt entegrite nan objektif asid nikleyik
(a) Yon espas 3′-5′ sou tou de seksyon yo pral lakòz yon repo nan ADN sib la. sentèz ADN ap toujou fèt sou ti fragman an. Sepandan, si yon sit rkwit Jadendanfan ki manke sou fragman ADN la, sèlman anplifikasyon lineyè rive. Nan ka ki pi favorab, fragman yo ka resature youn ak lòt, men pwodiksyon an ap piti ak pi ba pase nivo deteksyon yo.
(b) Pèt baz, sitou akòz depurinasyon ak fòmasyon thymidine dimer, mennen nan yon diminisyon nan kantite H-bond ak yon diminisyon nan Tm. Pandan faz chofe long la, primè yo pral fonn lwen ADN matris la epi yo pa pral rkwit menm nan kondisyon mwens sevè.
(c) Baz thymine adjasan yo fòme yon dimè TT.
Yon lòt pwoblèm komen ki souvan rive nan dyagnostik molekilè se lage pi piti pase-optimal nan asid nikleyik sib konpare ak ekstraksyon fenol-kloroform. Nan ka ekstrèm, sa ka asosye ak fo negatif. Anpil tan ka sove pa bouyi lysis oswa dijesyon anzimatik nan debri selil, men metòd sa a souvan rezilta nan ba sansiblite PCR akòz ensifizan lage asid nikleyik.

Anpèchman aktivite polymerase pandan anplifikasyon

An jeneral, anpèchman yo itilize kòm yon konsèp veso pou dekri tout faktè ki mennen nan rezilta PCR ki pa pi bon. Nan yon sans estrikteman byochimik, anpèchman limite a aktivite anzim nan, sa vle di, li diminye oswa anpeche konvèsyon substra-pwodwi atravè entèraksyon ak sit aktif nan ADN polymerase a oswa kofaktè li yo (egzanp, Mg2 + pou Taq DNA polymerase).
Konpozan nan echantiyon an oswa divès kalite tanpon ak ekstrè ki gen reyaktif ka dirèkteman anpeche anzim la oswa pyèj kofaktè li yo (egzanp EDTA), kidonk inaktive polymerase a epi an vire mennen nan diminye oswa fo rezilta PCR negatif.
Sepandan, anpil entèraksyon ant eleman reyaksyon ak asid nikleyik ki gen sib yo deziyen tou kòm 'inibitè PCR'. Yon fwa ke entegrite selil la deranje pa izolasyon ak asid nikleyik lage, entèraksyon ant echantiyon an ak solisyon ki antoure li yo ak faz solid ka rive. Pou egzanp, 'scavengers' ka mare ADN sèl-oswa doub-chèn atravè entèraksyon ki pa kovalan epi entèfere ak izolasyon ak pirifikasyon lè yo diminye kantite sib ki evantyèlman rive nan veso reyaksyon PCR la.
An jeneral, inibitè PCR yo prezan nan pifò likid kò ak reyaktif yo itilize pou tès dyagnostik klinik (ure nan pipi, emoglobin ak eparin nan san), sipleman dyetetik (konpozan òganik, glikojèn, grès, iyon Ca2 +) ak konpozan nan anviwònman an (fenol). , metal lou)

Yo ka jwenn plis inibitè PCR nan bakteri ak selil ekaryotik, ADN ki pa sib, makromolekil ADN-obligatwa nan matris tisi ak ekipman laboratwa tankou gan ak plastik. Pirifikasyon asid nikleyik pandan oswa apre ekstraksyon se metòd pi pito pou retire inhibiteurs PCR.
Jodi a, divès kalite ekipman ekstraksyon otomatik ka ranplase anpil pwotokòl manyèl, men 100% rekiperasyon ak / oswa pirifikasyon nan objektif pa janm te reyalize. Inibitè potansyèl yo ka toujou prezan nan asid nikleyik yo pirifye oswa yo ka deja pran efè. Diferan estrateji egziste pou redwi enpak inhibiteurs. Chwa a nan polymerase ki apwopriye a ka gen yon enpak siyifikatif sou aktivite inhibiteur. Lòt metòd pwouve pou diminye anpèchman PCR yo ogmante konsantrasyon polymerase oswa aplike aditif tankou BSA.
Anpèchman reyaksyon PCR yo ka demontre lè w itilize kontwòl kalite pwosesis entèn (IPC).
Yo dwe pran prekosyon pou retire tout reyaktif ak lòt solisyon ki nan twous ekstraksyon an, tankou etanòl, EDTA, CETAB, LiCl, GuSCN, SDS, izopropanol ak fenol, nan izole asid nikleyik la pa yon etap lave apwofondi. Tou depan de konsantrasyon yo, yo ka aktive oswa anpeche PCR.