Faktè entèferans nan reyaksyon PCR yo

Pandan reyaksyon PCR a, souvan gen kèk faktè entèferans ki ka rankontre.
Akòz sansiblite PCR ki wo anpil, kontaminasyon konsidere kòm youn nan faktè ki pi enpòtan ki afekte rezilta PCR yo epi li ka pwodui rezilta fo pozitif.
Divès sous ki mennen nan rezilta fo negatif yo egalman enpòtan. Si youn oubyen plizyè pati esansyèl nan melanj PCR a oubyen reyaksyon anplifikasyon an li menm bloke oubyen entèfere ak yo, tès dyagnostik la ka bloke. Sa ka mennen nan yon efikasite redwi e menm rezilta fo negatif.
Anplis inibisyon, pèt entegrite asid nikleyik sib la ka rive akòz kondisyon transpò ak/oswa depo anvan preparasyon echantiyon an. An patikilye, tanperati ki wo oswa depo ki pa apwopriye ka lakòz domaj nan selil yo ak asid nikleyik yo. Fiksasyon selil ak tisi ak enklizyon nan parafin se kòz byen koni nan fragmentasyon ADN ak yon pwoblèm pèsistan (gade Figi 1 ak 2). Nan ka sa yo, menm izolasyon ak pirifikasyon optimal p ap ede.

Figi 1 | Efè imobilizasyon sou entegrite ADN nan
Elektwoforèz jèl agaroz te montre ke kalite ADN ki te izole nan seksyon parafin otopsi yo te varye anpil. ADN ki gen diferan longè mwayèn fragman te prezan nan ekstrè yo selon metòd fiksasyon an. ADN te konsève sèlman lè li te fikse nan echantiyon natif natal konjele ak nan formalin net tampone. Itilizasyon yon fiksatif Bouin ki trè asid oswa formalin san tampon ki gen asid formik te lakòz yon pèt ADN enpòtan. Fraksyon ki rete a trè fragmenté.
Sou bò gòch la, longè fragman yo eksprime an pè kilobaz (kbp)

Figi 2 | Pèt entegrite sib asid nikleyik yo
(a) Yon espas 3′-5′ sou tou de fil ADN yo ap lakòz yon kase nan ADN sib la. Sentèz ADN nan ap toujou fèt sou ti fragman an. Sepandan, si yon sit koneksyon amorseur manke sou fragman ADN nan, se sèlman anplifikasyon lineyè ki fèt. Nan ka ki pi favorab la, fragman yo ka resatire youn lòt, men rannman yo ap piti epi anba nivo deteksyon yo.
(b) Pèt baz yo, sitou akòz depurinasyon ak fòmasyon dimè timidin, mennen nan yon diminisyon nan kantite lyezon H ak yon diminisyon nan Tm. Pandan faz rechofman pwolonje a, primè yo ap fonn lwen ADN matris la epi yo p ap rekwi menm nan kondisyon ki mwens strik.
(c) Baz timin adjasan yo fòme yon dimè TT.
Yon lòt pwoblèm komen ki souvan rive nan dyagnostik molekilè se liberasyon asid nikleyik sib yo ki pa optimal konpare ak ekstraksyon fenòl-klorofòm. Nan ka ekstrèm, sa ka asosye avèk fo negatif. Yo ka ekonomize anpil tan lè yo itilize liziz nan ebulisyon oswa dijesyon anzimatik debri selilè yo, men metòd sa a souvan lakòz yon sansiblite PCR ki ba akòz liberasyon asid nikleyik ki pa ase.

Inibisyon aktivite polimeraz pandan anplifikasyon

An jeneral, yo itilize inibisyon kòm yon konsèp kontenè pou dekri tout faktè ki mennen nan rezilta PCR ki pa optimal. Nan yon sans estrikteman byochimik, inibisyon limite a aktivite anzim lan, sa vle di, li diminye oswa anpeche konvèsyon substrat-pwodwi atravè entèraksyon ak sit aktif ADN polimeraz la oswa kofaktè li a (pa egzanp, Mg2+ pou Taq ADN polimeraz).
Konpozan nan echantiyon an oswa divès tanpon ak ekstrè ki gen reyaktif yo ka dirèkteman anpeche anzim lan oswa pran kofaktè li yo (pa egzanp EDTA), kidonk inaktive polimeraz la e sa ka lakòz rezilta PCR ki diminye oswa ki fo negatif.
Sepandan, anpil entèraksyon ant konpozan reyaksyon yo ak asid nikleyik ki gen sib yo deziyen tou kòm 'inibitè PCR'. Yon fwa entegrite selil la deranje pa izolasyon an epi asid nikleyik la libere, entèraksyon ant echantiyon an ak solisyon ki antoure li a ak faz solid la ka rive. Pa egzanp, 'netwayaj' yo ka mare ADN yon sèl oswa doub fil atravè entèraksyon ki pa kovalan epi entèfere ak izolasyon ak pirifikasyon an lè yo diminye kantite sib ki evantyèlman rive nan veso reyaksyon PCR a.
An jeneral, inibitè PCR yo prezan nan pifò likid kòporèl ak reyaktif yo itilize pou tès dyagnostik klinik (ure nan pipi, emoglobin ak eparin nan san), sipleman dyetetik (konpozan òganik, glikojèn, grès, iyon Ca2+) ak konpozan nan anviwònman an (fenòl, metal lou).

Yo ka jwenn inibitè PCR ki pi komen nan bakteri ak selil eukaryotik, ADN ki pa sib, makromolekil ki mare ADN nan matris tisi ak ekipman laboratwa tankou gan ak plastik. Pirifikasyon asid nikleyik pandan oswa apre ekstraksyon an se metòd ki pi pito pou retire inibitè PCR yo.
Jodi a, plizyè ekipman ekstraksyon otomatik ka ranplase anpil pwotokòl manyèl, men yo pa janm rive nan 100% rekiperasyon ak/oswa pirifikasyon sib yo. Gen inibitè potansyèl ki ka toujou prezan nan asid nikleyik pirifye yo oswa yo ka deja pran efè. Gen diferan estrateji ki egziste pou diminye enpak inibitè yo. Chwa polimeraz ki apwopriye a ka gen yon enpak siyifikatif sou aktivite inibitè a. Gen lòt metòd pwouve pou diminye inibisyon PCR tankou ogmante konsantrasyon polimeraz oswa aplike aditif tankou BSA.
Yo ka demontre inibisyon reyaksyon PCR yo lè yo itilize kontwòl kalite pwosesis entèn (IPC).
Fòk ou pran prekosyon pou retire tout reyaktif ak lòt solisyon ki nan twous ekstraksyon an, tankou etanòl, EDTA, CETAB, LiCl, GuSCN, SDS, izopropanòl ak fenòl, nan izole asid nikleyik la avèk yon etap lavaj konplè. Tou depan de konsantrasyon yo, yo ka aktive oswa anpeche PCR.