Faktè entèferans nan reyaksyon PCR

Pandan reyaksyon PCR la, kèk faktè entèfere yo souvan rankontre.
Akòz sansiblite a trè wo nan PCR, se kontaminasyon konsidere kòm youn nan faktè ki pi enpòtan ki afekte rezilta PCR epi yo ka pwodwi fo rezilta pozitif.
Egal-ego kritik yo se divès sous yo ki mennen nan fo-negatif rezilta yo. Si youn oswa plis pati esansyèl nan melanj lan PCR oswa reyaksyon an anplifikasyon tèt li yo inibe oswa entèfere ak, ka tès la dyagnostik dwe anpeche. Sa ka lakòz efikasite redwi e menm fo rezilta negatif.
Anplis de anpèchman, pèt nan sib entegrite asid nikleyik ka rive akòz anbake ak/oswa kondisyon depo anvan preparasyon echantiyon. An patikilye, tanperati ki wo oswa depo apwopriye ka mennen nan domaj nan selil yo ak asid nikleyik. Selil ak tisi determinasyon ak parafine embedding yo byen li te ye kòz nan fwagmantasyon ADN ak yon pwoblèm ki pèsistan (al gade figi 1 ak 2). Nan ka sa yo, menm pi bon izolasyon ak pirifye pa pral ede.

Figi 1 | Efè imobilizasyon sou entegrite ADN
Electrophoresis jèl agarose te montre ke bon jan kalite a nan ADN lan izole nan seksyon parafine nan otopsi varye konsiderableman. ADN diferan longè fragman mwayèn te prezan nan Ekstrè yo depann sou metòd la determinasyon. ADN te konsève sèlman lè fiks nan echantiyon natif natal nan frizè ak nan tampon formalin net. Itilize yon fòtman asid Bouin fixative oswa unbuffered, fòmik asid ki gen fòmal ki te lakòz yon pèt siyifikatif nan ADN. Se fraksyon ki rete a trè fragmenté.
Sou bò gòch la, se longè a nan fragman eksprime nan Kilobase pè (KBP)

Figi 2 | Pèt entegrite nan objektif asid nikleyik
(a) A 3′-5 ′ diferans sou tou de seksyon yo pral rezilta nan yon ti repo nan ADN nan sib. Sentèz ADN ap toujou rive sou ti fragman an. Sepandan, si yon sit rkwir Jadendanfan ki manke sou fragman ADN lan, sèlman anplifikasyon lineyè rive. Nan ka ki pi favorab, fragman yo ka rezature youn ak lòt, men pwodiksyon an yo pral ti ak anba nivo deteksyon.
(b) Pèt nan baz, sitou akòz depurination ak timidine fòmasyon dimè, mennen nan yon diminisyon nan kantite H-lyezon ak yon diminisyon nan TM. Pandan faz la planèt la long, prime yo pral fonn lwen ADN nan matris epi yo pa pral anneal menm nan kondisyon mwens sevè.
(c) baz timin adjasan fòme yon dimè TT.
Yon lòt pwoblèm komen ki souvan rive nan diagnostics molekilè se liberasyon an mwens-pase-optimal nan sib asid nikleyik konpare ak fenol-klorofòm ekstraksyon. Nan ka ekstrèm yo, sa ka asosye avèk fo negatif. Anpil tan ka sove pa lysis bouyi oswa dijesyon anzimatik nan debri selil, men metòd sa a souvan rezilta nan sansiblite ki ba PCR akòz ase lage asid nikleyik.

Anpèchman nan aktivite polymerase pandan anplifikasyon

An jeneral, yo itilize anpèchman kòm yon konsèp veso a dekri tout faktè ki mennen nan suboptimal rezilta PCR. Nan yon sans entèdi byochimik, anpèchman limite a aktivite anzim la, sa vle di, li diminye oswa anpeche konvèsyon substrate-pwodwi nan entèraksyon ak sit la aktif nan polimeraz la ADN oswa kofaktè li yo (egzanp, Mg2+ pou Taq ADN polymerase).
Konpozan nan echantiyon an oswa divès kalite tanpon ak Ekstrè ki gen reyaktif ka dirèkteman anpeche anzim la oswa pèlen kofaktè li yo (egzanp EDTA), kidonk inaktif polymerase a ak nan vire ki mennen ale nan diminye oswa fo rezilta negatif PCR.
Sepandan, anpil entèraksyon ant eleman reyaksyon ak sib ki gen asid nikleyik yo tou deziyen kòm 'inhibiteurs PCR'. Yon fwa entegrite nan selil la deranje pa izolasyon ak asid nikleyik la lage, entèraksyon ant echantiyon an ak solisyon ki antoure li yo ak faz solid ka rive. Pou egzanp, 'Scavengers' ka mare yon sèl- oswa ADN doub-bloke nan entèraksyon ki pa kovalan ak entèfere ak izolasyon ak pou pirifye pa diminye kantite objektif ki evantyèlman rive nan veso a reyaksyon PCR.
An jeneral, inhibiteurs PCR yo prezan nan pifò likid kò ak reyaktif yo itilize pou tès klinik dyagnostik (ure nan pipi, emoglobin ak eparin nan san), sipleman dyetetik (konpozan òganik, glikojèn, grès, iyon Ca2+) ak konpozan nan anviwònman an (fenol, metal lou)

Plis inhibiteurs PCR répandus ka jwenn nan bakteri ak selil ekaryotik, ki pa sib ADN, ADN-obligatwa makromolekul nan matris tisi ak ekipman laboratwa tankou gan ak plastik. Pirifye nan asid nikleyik pandan oswa apre ekstraksyon se metòd la pi pito pou retire inhibiteurs PCR.
Jodi a, divès kalite ekipman ekstraksyon otomatik ka ranplase anpil pwotokòl manyèl, men 100% rekiperasyon ak/oswa pou pirifye nan objektif pa janm te reyalize. Potansyèl inhibiteurs ka toujou prezan nan pirifye asid nikleyik yo oswa yo ka deja pran efè. Diferan estrateji egziste pou redwi enpak inhibiteurs yo. Chwa a nan polimeraz ki apwopriye a ka gen yon enpak siyifikatif sou aktivite inhibiteur. Lòt metòd pwouve diminye anpèchman PCR yo ap ogmante konsantrasyon polymérase oswa aplike aditif tankou BSA.
Anpèchman nan reyaksyon PCR ka demontre pa itilize nan entèn pwosesis kontwòl kalite (IPC).
Ou dwe pran swen pou retire tout reyaktif yo ak lòt solisyon nan twous ekstraksyon an, tankou etanòl, EDTA, CETAB, LiCl, GUSCN, SDS, izopropanol ak fenol, ki soti nan asid nikleyik izole pa yon etap lave bon jan. Tou depan de konsantrasyon yo, yo ka aktive oswa anpeche PCR.